Glitsiram-glycyram

Odůvodnění. Léčivý rostlinný materiál „kořeny lékořice“ obsahuje celý komplex biologicky aktivních látek (triterpenové saponiny, flavonoidy atd.) a je široce používán v lékařské praxi jako surovina pro získávání protizánětlivých a expektoračních činidel. Navzdory širokému použití v medicíně a studiu jeho chemického složení přitom zůstávají aktuální problémy v oblasti standardizace kořenů lékořice. Současná lékopisná metoda stanovení kvantitativního obsahu kyseliny glycyrrhizové je vícestupňová: zahrnuje extrakci kyseliny dusičné 3% roztokem acetonu, přidávání koncentrovaného roztoku amoniaku, dokud se nevytvoří sraženina (amonná sůl kyseliny glycyrrhizové). , její filtrace a rozpuštění ve vodě s následnou spektrofotometrickou analýzou. Jsou známy další způsoby stanovení obsahu této biologicky aktivní sloučeniny za použití metody vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Při analýze známých roztoků ve vědecké literatuře nebyly nalezeny žádné výsledky studií kvantitativního hodnocení kyseliny glycyrrhizové touto metodou v izokratickém elučním režimu.

terč — vývoj metody pro stanovení kvantitativního obsahu kyseliny glycyrrhizové v kořenech lékořice metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie v izokratickém elučním režimu.

Materiály a metody. Předmětem studie byly kořeny lékořice nahé, sklizené v roce 2018 v Botanické zahradě univerzity Samara, komerční vzorky rostlinných materiálů, státní standardní vzorky monosubstituované amonné soli kyseliny glycyrrhizové (glycyram, FS 42-0034-00) a pracovní standardní vzorek kyseliny glycyrrhizové. Pro analýzu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie byl použit chromatograf Milichrom-6.

Výsledky. V důsledku provedeného výzkumu byla vyvinuta metoda pro stanovení kvantitativního obsahu kyseliny glycyrrhizové pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi s ultrafialovou detekcí (258 nm), mobilní fází je acetonitril: 1% roztok kyseliny octové v vody v poměru 40:60, rychlost eluce je 100 μl/min. Byly zvoleny optimální podmínky extrakce: extrakční činidlo – 40% etanol, extrakce po dobu 60 min při poměru surovina/extrakt 1:30 Validační analýza ukázala, že vyvinuté metody se vyznačují vyhovujícími metrologickými ukazateli.

Závěr. Získané výsledky lze použít k aktualizaci lékopisného článku „Kořeny lékořice“.

Klíčová slova

Plný text

Odůvodnění

Nahá lékořice (Glycyrrhiza glabra L.) a lékořice uralská (Glycyrrhiza uralensis Fisch.) je široce používán v oficiální medicíně k získávání léčivých přípravků s širokým spektrem farmakologické aktivity [4–7]. Lékopisnou surovinou pro oba druhy rostlin jsou kořeny [6]. Přípravky na bázi kořenů lékořice (husté a suché extrakty, lékořicový sirup, vícesložkové bylinné nálevy, balzámy, „Hrudní elixír“ aj.) se používají jako protizánětlivé, expektorans, antihistaminika, imunomodulační a protivředové látky [3].

Hlavními biologicky aktivními sloučeninami surovin a přípravků lékořice nahé a lékořice uralské jsou triterpenové saponiny (kyselina glycyrrhizová) a flavonoidy (licurasid) (obr. 1, 2) [1, 4–7].

Obr. 1. Strukturní vzorec kyseliny glycyrrhizové / Fík, 1. Strukturní vzorec kyseliny glycyrrhizové

Rýže, 2. Strukturální vzorec licurasida / Obr. 2. Strukturní vzorec licurasidu

V současné době se kvalita kořenů lékořice posuzuje podle obsahu kyseliny glycyrrhizové, pro jejíž kvantitativní stanovení se v surovinách a léčivých přípravcích v Rusku tradičně používá metoda spektrofotometrie [2, 6]. V aktuálním lékopisném článku „Lékořice kořeny“ (FS.2.5.0040.15) je pro kvantitativní stanovení této biologicky aktivní sloučeniny použita vícestupňová metoda, která zahrnuje extrakci surové kyseliny dusičné 3% roztokem acetonu s přídavkem koncentrovaný roztok amoniaku do výsledného extraktu, dokud se neobjeví světle žlutý sražený sediment, filtrace a rozpuštění výsledné sraženiny ve vodě, následované spektrofotometrickým stanovením kyseliny glycyrrhizové při analytické vlnové délce 258 nm [2].

Zavedení tenkovrstvé chromatografie, vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), NMR spektroskopie a dalších metod do oblasti farmacie zároveň otevřelo nové možnosti pro zlepšení standardizace léčivých rostlinných materiálů a rostlinných přípravků. V odborné literatuře byly publikovány nefarmakopeiální metody stanovení kyseliny glycyrrhizové v lékořicových surovinách a přípravcích pomocí metod HPLC a kapilární elektroforézy [8–14]. Způsob stanovení této sloučeniny pomocí mikrokolonové HPLC je známý. Extrakce se provádí 50% ethanolem v ultrazvukové lázni s následnou chromatografickou separací za použití gradientového systému [4,1 M LiClO₄ v 0,1 M HCXNUMXO₄ (eluent A) – acetonitril (eluent B); [eluční režim 10–60 % eluentu B (0–5 min)]. Teplota kolony byla 35 °C, průtok mobilní fáze byl 600 ul/min a vlnová délka detektoru byla 252, 276 a 360 nm [8].

Tyto studie prokazují opodstatněnost a nutnost použití metody HPLC pro analýzu kyseliny glycyrrhizové v surovinách a přípravcích lékořice namísto současné vícestupňové spektrofotometrické metody. Zároveň je známo, že v gradientním režimu může být korekce podmínek kritičtější, což může vést k nesprávné identifikaci vrcholů, jejich překrývání nebo posunům. Při analýze známých roztoků ve vědecké literatuře nebyly nalezeny žádné výsledky studií kvantitativního hodnocení kyseliny glycyrrhizové pomocí HPLC v izokratickém elučním režimu.

Účel výzkumu — vývoj metody pro stanovení kvantitativního obsahu kyseliny glycyrrhizové v kořenech lékořice metodou HPLC v izokratickém elučním režimu.

Materiály a metody

Výzkumný materiál zahrnoval kořeny lékořice nahé, sklizené v roce 2018 v Botanické zahradě univerzity Samara, komerční vzorky rostlinných materiálů (JSC Krasnogorskleksredstva, LLC ALSU), státní standardní vzorky (SSS) monosubstituované amonné soli kyseliny glycyrrhizové (glycyram, FS 42-0034-00) a pracovní standardní vzorek kyseliny glycyrrhizové. Použití glycyramu jako GSO je způsobeno skutečností, že kyselina glycyrrhizová je nestabilní látka, která vyžaduje vícestupňový postup čištění, což v konečném důsledku nezajistí vysoký stupeň čistoty izolované sloučeniny.

HPLC analýza byla provedena pomocí chromatografu Milichrom-6 (NPAO Nauchpribor) za následujících podmínek chromatografie na reverzní fázi v izokratickém režimu: ocelová kolona KAKh-6-80-4 (2 × 80 mm; Separon-C18 7 μm), mobilní fáze – acetonitril: 1% roztok kyseliny octové ve vodě v poměru 40:60, rychlost eluce – 100 μl/min, objem eluentu – 2000 μl. Detekce látek byla prováděna při vlnové délce 256 nm (odpovídající maximální absorpci kyseliny glycyrrhizové).

Výsledky a diskuse

Při vývoji metody HPLC byl zvolen rozpouštědlový systém (směs acetonitrilu a 1% vodného roztoku kyseliny octové v různých poměrech). Výsledky výběru rozpouštědlového systému ukázaly, že optimálním systémem, ve kterém je pozorována dobrá separace látek jak jednotlivých, tak v extraktu, je směs acetonitrilu a vody v poměru 40:60.

Aby se otestovala vhodnost chromatografického systému, 5 ul roztoku extraktu z kořene lékořice byly 4krát chromatografovány. Poté byly vypočteny následující parametry: účinnost kolony, rozlišení mezi vrcholy a faktor asymetrie. Získané hodnoty odpovídaly standardním indikátorům v souladu s OFS.1.2.1.2.0001.15 „Chromatografie“.

Retenční čas píku odpovídajícího kyselině glycyrrhizové na chromatogramu extraktů ze studovaných vzorků kořenů lékořice odpovídal retenčním časům píku glycyramu na chromatogramu glycyramu GSO a píku kyseliny glycyrrhizové na chromatogramu pracovního standardu. vzorku (6,661 ± 0,129, 6,555 ± 0,120 a 6,665 ± 0,140 min, v tomto pořadí) (obr. 3, 4).

Obr. 3. Vysoce výkonný kapalinový chromatogram standardního roztoku glycyramu: * – glycyram / Obr. 3. Vysoce výkonný kapalinový chromatogram standardního roztoku glycyramu: * — glycyram

Obr. 4. Vysoce výkonný tekutý chromatogram extraktu z kořene lékořice: * – kyselina glycyrrhizová / Obr. 4. Vysoce výkonný kapalinový chromatogram extraktu z kořenů lékořice: * — kyselina glycyrrhizová

Pomocí metody HPLC byla vyvinuta metoda pro kvantitativní stanovení obsahu kyseliny glycyrrhizové v surovinách. Závislost výšky chromatografického píku na koncentraci kyseliny glycyrrhizové byla popsána lineární regresí v koncentračním rozmezí od 184 do 1475 μg/ml (r 2 = 0,9994). Přesnost metody byla stanovena přidáním roztoků kyseliny glycyrrhizové o známé koncentraci (80, 100 a 120 %) do testovaného roztoku. Průměrné procento obnovy bylo 97,2 %. Chyby ve stanovení kyseliny glycyrrhizové ve vzorcích s přídavkem standardních vzorků byly v mezích chyb jediného stanovení, což svědčí o absenci systematické chyby. Chyba při stanovení průměrného výsledku obsahu kyseliny glycyrrhizové v kořenech lékořice s hladinou spolehlivosti 95 % je ±4,11 % (tabulka 1).

Tabulka 1. Metrologické charakteristiky metody kvantitativního stanovení kyseliny glycyrrhizové v kořenech lékořice / Tabulka 1. Metrologické charakteristiky metody pro kvantitativní stanovení kyseliny glycyrrhizové v kořenech lékořice