Co znamená jeden řádek na testu?

Po uvedení slavného Dudova filmu byla většina nevládních organizací působících v oblasti HIV zavalena vlnou lidí, kteří se chtěli nechat otestovat. Včetně AIDS.CENTER – tok klientů se zvýšil téměř trojnásobně a na testování přišli lidé, kteří nikdy předtím nenavštívili otevřený prostor nadace v Artplay.

Sám Dud byl ale testován v prostorách naší nadace, tyto záběry jsou ve filmu. Po dásni přejede bílou špachtlí s plastovou rukojetí, poté předloží výsledek – jeden proužek. „Zdravý!“

Pro velký zájem veřejnosti, včetně klientů, kteří přišli do našeho loftu na Nižňaja Syromjatničeskaja, vám dnes prozradíme, jak tyto a další HIV testy fungují. Proč se na rukojeti testeru objevují pruhy, jak spolehlivé a validní je takové testování a hlavně jaké alternativy existují.

Vše, co jste chtěli vědět o technologii testování HIV, je v jednom článku.

Všechny testy HIV jsou navrženy tak, aby buď našly části viru, nebo zaznamenaly reakci těla na jeho přítomnost. Proto, abyste pochopili, jak testy HIV fungují, musíte mít hrubou představu o tom, jak je virus strukturován a jak se chová, jakmile je v buňce.

Virus HIV je členem rodiny retrovirů (Retroviridae). Členové této rodiny vypadají jako drobné kulaté částice, které mají skořápku pokrytou speciálními bílkovinami. Pomocí těchto proteinů virus rozpozná buňku oběti a naváže se na ni.

Poté se membrány buňky a viru spojí a obsah viru, nukleokapsida, vstoupí do buňky. Nukleokapsida je proteinová kapsle, která obsahuje genetickou informaci o struktuře viru – dvě kopie dvouvláknové RNA – a sadu enzymů, které „zapnou“ RNA, jakmile vstoupí do buňky. Po splynutí viru s buňkou se nukleokapsida otevře, dovnitř vstoupí RNA a virové enzymy a samotný virus zahájí svou špinavou práci.

Existuje mnoho testů na HIV, ale lze je rozdělit do několika velkých typů. Rychlé testy používané většinou nevládních organizací poskytujících služby v oblasti HIV jsou založeny na principu enzymatické imunoanalýzy neboli ELISA.

Jejich úkolem je identifikovat protilátky proti HIV, které tělo produkuje jako odpověď na virus, který do něj vstoupí.

Jak to funguje? Když se virus HIV dostane do těla, lidský imunitní systém nesedí nečinně. Začne produkovat protilátky – imunitní proteiny, které pomáhají tělu bojovat s infekcí. Tyto proteiny lze nalézt v mnoha biologických tekutinách.

Existuje mnoho způsobů, jak takové protilátky detekovat. Nejpopulárnější je však enzymová imunoanalýza (ELISA). V zahraničí se tento test nazývá enzyme-linked immunosorbent assay, nebo zkráceně ELISA.

Princip ELISA je založen na reakci antigen-protilátka. Člověku se odebírá krev nebo tekutina z dásní (ne přesně slin), které mohou obsahovat protilátky proti viru HIV.

Poté se k němu přidá činidlo s proteiny viru HIV, nebo spíše antigeny, ale ne jednoduché, ale „upravené“. Antigen použitý v reakci se liší od normálního virového proteinu tím, že je k němu připojena chemická značka.

Zatímco „značené“ antigeny plavou v činidle samy, nic se neděje. Pokud jsou však v biologické tekutině protilátky proti HIV, spojí se s „značenými“ antigeny a vydají signál, který může být detekován laboratorním technikem nebo expresním testem. Pokud neexistují protilátky proti HIV, nebude žádný signál.

V rychlých testech používaných nadací AIDS.CENTER a mnoha našimi kolegy pro bezplatné a anonymní testování jsou protilátky aplikovány v tenké linii na speciální povrch skrytý pod plastovým tělem testeru.

Nejprve klient odsaje gingivální tekutinu špachtlí připojenou ke konci testeru. Jakmile je tekutina shromážděna, laboratorní technik ponoří špachtli do činidla, které se během 15 minut zvedne nad testerem a nakonec se dostane k proužku s antigeny.

Pokud byly v gingivální tekutině smíchané s činidlem protilátky, proužek zčervená.

Na rukojeti testeru je zpravidla druhý proužek – kontrolní proužek, je vždy zbarven červeně. Takže zpravidla negativní výsledek (v těle není žádný virus) je označen jedním proužkem na rukojeti testeru a pozitivní výsledek (v těle je virus) je označen dvěma.

Dva proužky na testeru jsou neklamným znamením, že člověk byl před časem infikován virem HIV. Klient proto nutně potřebuje navštívit lékaře na terapii – v krajském nebo městském AIDS centru. Tam mu budou provedeny potvrzující testy a předepsána antiretrovirová terapie.

Úplně stejný test (ELISA), pouze laboratorní, lze provést na mnoha komerčních klinikách – ale za peníze. Jeho technologie vypadá obecně stejně, ale přesnost se liší jen nepatrně.

<strong>Jaké typy testů ELISA existují?</strong>

● „Domácí“ expresní test – OraQuick HIV ½ Rapid Antibody Test. Materiálem pro test je kapalina, která se sbírá z dásní speciálním měkkým kartáčkem. Test dává výsledky velmi rychle: do 20 minut.

● Laboratorní ELISA test – analýza HIV podle formuláře 50. U nás se používá jako standardní postup pro laboratorní diagnostiku infekce HIV. Materiálem pro rozbor je krev ze žíly, která musí být darována do laboratoře. Výsledky se dostaví za 1-5 dní.

<strong>Co je důležité vědět o testech ELISA?</strong>

Všechny testy ELISA mají dvě vážné nevýhody. Za prvé, testy ELISA neodhalí virus HIV bezprostředně po infekci. To se děje proto, že protilátky proti viru HIV se nevytvářejí okamžitě. Moderní testy ELISA mohou detekovat imunitní proteiny pouze 23–90 dní po infekci. Pokud provedete test před tímto datem, můžete spadnout do „sérologického okna“ – to je doba, během níž imunitní systém ještě neměl čas vytvořit protilátky proti virovým proteinům, ačkoli virus již v těle je.

Za druhé, testy HIV ELISA někdy dávají falešně pozitivní výsledky – to znamená, že „najdou“ virus HIV u lidí, kteří jej ve skutečnosti nemají. Laboratorní test ELISA na HIV může být stejně náchylný k chybám jako rychlý test. To je důvod, proč všechny pozitivní testy ELISA obvykle podléhají ověření pomocí spolehlivějších metod. U nás se k tomu používá Western blotting.

Potvrzující testy: Western blot (WB)

Účelem tohoto testu je potvrdit výsledky počáteční analýzy.

Western blotting lze provádět pouze v laboratoři. Takové testy nejsou „kapesní“, a proto všechny nevládní organizace, které testují občany na HIV, nakonec pošlou své klienty do laboratoří AIDS center, aby tento test provedli, pokud expresní tester ukáže pozitivní výsledek.

Western blot (neboli imunoblot) je stejná analýza ELISA založená na reakci „antigen-protilátka“, pouze velmi přesná, dlouhá a pečlivá.

K provedení analýzy je člověku odebrána krev a je z ní extrahováno sérum. Je to stále stejná krev, akorát bez červených krvinek, imunitních buněk a všeho dalšího, co může tvořit krevní sraženiny. Toto sérum se poté aplikuje na proužek nitrocelulózy, na který jsou v přísném pořadí umístěny různé antigeny HIV – proteiny z membrány a nukleokapsidy viru. Pokud se protilátky již objevily v krevním séru, navážou se na antigeny umístěné na proužku.

Poté se do směsi přidá nové činidlo, „vývojář“. Stejně jako ve fotografii je toto činidlo potřebné k pochopení, zda reakce proběhla nebo ne. „Vývojářské“ činidlo obsahuje protilátky označené chemickou značkou. Ale to nejsou protilátky proti antigenům viru HIV, ale proti lidským protilátkám, které se mohou vázat na komplex „antigen-protilátka“.

Pokud vzorek obsahuje komplex antigen-protilátka, objeví se na proužku barevné proužky. Každý proužek představuje svůj vlastní virový protein. Reakce je považována za velmi přesnou – ve většině případů umožňuje Western blotting vyloučit náhodné spuštění testu.

Jaké typy testů existují? Různé. Někdo může potvrdit přítomnost HIV-1, někdo může potvrdit přítomnost HIV-2 a někdo může potvrdit přítomnost obou typů viru.

Příklad: Ruský testovací systém IFA-Line-Blot-HIV-1,2. Tento testovací systém je zapojen do výběrových řízení – nákupů pro státní laboratoře, které působí při AIDS centrech.

<strong>Co je důležité vědět o Western blotu?</strong>

V Rusku je Western blotting považován za zlatý standard pro potvrzení infekce HIV. Problém je v tomhle.

1. Western blotting stále někdy dává neurčité výsledky. V této situaci bude muset být test opakován, ale až po třech týdnech.

2. Western blotting je drahý a časově náročný. Test vyžaduje složité vybavení, pečlivou práci a kvalifikovaný personál. A abyste pochopili výsledky, potřebujete pomoc odborníka.

Jaký je problém s ruskými testy na HIV?

U nás se k potvrzení HIV statusu používají laboratorní testy ELISA a Western blotting – jde o standardní postup. Světová zdravotnická organizace (WHO) však poznamenává, že v zemích, kde je tento systém zaveden, se na určování stavu HIV vynakládá mnoho času a peněz. Čekání na výsledky je navíc tak vyčerpávající, že někteří pacienti dokonce litují rozhodnutí zjistit svůj HIV status.

Odborníci WHO doporučují opustit laboratorní testy ELISA a Western blotting ve prospěch kombinovaných rychlých testů, které poskytují rychlejší a spolehlivější výsledky. A opravdu to funguje.

Například v USA se od Western blottingu, který „potvrzuje“ infekci, v zásadě upustilo. V této zemi se ke stanovení a potvrzení HIV statusu používají kombinované laboratorní a rychlé testy. Nejen, že je to levnější pro stát, ale také psychicky jednodušší pro lidi: jelikož je čekací doba kratší a samotný zákrok jednodušší, stále více Američanů se dozvídá svůj HIV status včas a zahajuje včasnou léčbu.

Kombinované testy

Účelem kombinovaných testů, jako je Western blotting, je určit HIV stav osoby.

Jedná se o stejný test ELISA, ale vylepšený – „dva v jednom“. Test nám umožňuje detekovat nejen lidské protilátky proti viru HIV, ale také virový antigen – protein p24. Vnitřní obal viru, nukleokapsid, o kterém jsme hovořili výše, je tvořen tímto proteinem.

Kombinované testy na HIV přicházejí také v domácí a laboratorní formě.

● Příkladem „domácího“ kombinovaného rychlého testu je analýza Alere HIV Combo. Tato analýza může být provedena pomocí krve z prstu (také pomocí séra, ale bude fungovat i „prostá“ krev) a výsledky jsou známy do 20 minut.

● Příkladem laboratorního kombinovaného testu je HIV Ag/Ab Combo, který se provádí v soukromých laboratořích za peníze.

Co je důležité vědět o tomto testu? Tato analýza patří do čtvrté generace. Dnes je považována za optimální metodu pro detekci infekce na celém světě, protože je levná a umožňuje poměrně brzy zjistit HIV stav klienta.

Pokud jde o stanovení HIV statusu, v Evropě a USA se nejčastěji uchylují ke kombinovaným testům. Pokud je test pozitivní, není třeba provádět potvrzující test, po nějaké době se jednoduše provede znovu – a to je považováno za docela spolehlivé.

Faktem je, že antigen – virový protein p24 – se objevuje v krvi již v prvním týdnu po infekci, tedy dlouho před tvorbou protilátek. Vzhledem k tomu, že kombinovaný test detekuje antigen, existuje možnost zjistit váš stav již 21-28 dní po podezření na infekci.

Jakmile se začnou vytvářet protilátky, virový protein p24 z krve zmizí. Někdy se to stane již ve druhém týdnu, ale u 90–95 % nakažených se protilátky objeví v krvi během prvních tří měsíců po infekci.

Není možné přesně předpovědět, kdy se protilátky objeví, protože tělo každého člověka reaguje na virus HIV jinak. Ale i když antigen p24 stihne z krve zmizet, kombinovaný test najde, když ne p24, tak alespoň protilátky, a přesto dá správnou odpověď.

PCR: nejsložitější analýza

Testy, které přímo detekují genetický materiál viru HIV, se nazývají reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce (RT-PCR).

Existuje mnoho metod polymerázové řetězové reakce (PCR), které lze použít k detekci viru HIV. Nejjednodušší způsob, jak pochopit, co se přesně děje ve zkumavce, je použít příklad reverzní transkripce PCR (RT-PCR).

Tento test detekuje HIV RNA v krvi. Abych to trochu zjednodušil, reakce vypadá takto. Nejprve se do séra obsahujícího virovou RNA přidá enzym, který „sestaví“ virovou DNA pomocí RNA jako templátu – to znamená, že udělá téměř totéž, co virus, když vstoupí do buňky.

Poté se provede standardní PCR reakce, která umožňuje zvýšit koncentraci DNA ve vzorku na hodnoty, které lze snadno zaznamenat. Za tímto účelem se do výsledné DNA přidávají nukleotidy – „stavební kameny“, ze kterých je DNA postavena – a enzym, který z těchto nukleotidů sestavuje druhý řetězec DNA. Aby enzym fungoval, vše se zahřeje na určitou teplotu a mnohokrát se opakuje, dokud se nenasbírá dostatek DNA. V této podobě lze test použít k určení stavu HIV osoby.

Reakci RT-PCR lze provádět v reálném čase. To pomáhá poměrně přesně pochopit, kolik virových částic je v těle. Typicky se to provádí přidáním kousku DNA do reakční směsi, označeného chemickou látkou, která začne svítit, když je kousek DNA začleněn do molekuly. Protože tento kousek DNA odpovídá pouze jedné části virové DNA, je možné spočítat počet vzplanutí a určit, kolik virové RNA bylo původně ve vzorku.

Video: Jak funguje test PCR

Jaké typy testů PCR existují? Polymerázová řetězová reakce je čistě laboratorní test. Neexistují na něm žádné expresní testy, protože v okamžiku, kdy je DNA „kompletní“, je potřeba směs zahřát. A aby bylo možné „přečíst“ výsledek, je zapotřebí drahé vybavení.

RT-PCR je velmi citlivý test, který dokáže detekovat i velmi malé množství viru v krvi. Navíc je to docela brzy: protože analýza nevyžaduje čekání, až se protilátky a virové proteiny objeví v krvi, bude „fungovat“ během několika dnů nebo týdnů po kontaktu s HIV.

Tento test je ale velmi drahý a složitý. Není to však jediný důvod, proč se nepoužívá ke zjištění HIV statusu u všech, i když to lze za peníze udělat v soukromé laboratoři. Faktem je, že test je vhodný pro detekci pouze jednoho typu viru – HIV-1. Nenajde HIV-2. Testy HIV PCR se proto obvykle používají pouze ke sledování léčby osoby, která již zná svůj HIV status.

Tento materiál pro vás připravila redakce nadace. Existujeme díky vaší pomoci. Můžete nám pomoci právě teď.